Publisko datu analīze
Dati par SARS-CoV-2 izcelsmi un datums, kad paraugs tika ņemts no sekvencēm, kas pieejamas Čīlē, tika iegūti Consorcio Genomas CoV2 vietnē, kas pieejama vietnē https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Vakcinācijas dati tika iegūti no Zinātnes, tehnoloģiju, zināšanu un inovāciju ministrijas publiskajiem datiem, kas pieejami vietnē https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (83. produkts).
Infekcijas tests
Pseidotipēti vīrusi, kas satur dažādus SARS-CoV-2 smaiļu proteīnus, tika sagatavoti, kā mēs iepriekš aprakstījām12. Īsumā, uz HIV-1 balstīti SARS-CoV-2 pseidotipi tika ražoti HEK293T šūnās, transfektējot pNL4.3-ΔEnv-Luc kopā ar atbilstošo pCDNA-SARS-CoV-2 Spike kodēšanas vektoru molārā attiecībā 1:1. Plazmīdas, kas kodē kodonu optimizētu smaili, kam trūkst pēdējo 19 C-gala gala aminoskābju (SΔ19), kas, kā zināms, novērš aizturi endoplazmatiskajā retikulumā12 tika iegūti ar gēnu sintēzi vai pielāgotu vietni orientētu mutaģenēzi (GeneScript), un tajos bija šādas mutācijas: līnija A (atsauces secība), līnija B (D614G), līnija B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), līnija P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027, Δ37V, T75 76- 246, L252Q, F452S, D490G, T614N). Katrs pseidotipa preparāts tika notīrīts, centrifugējot ar ātrumu 859 apgr./min istabas temperatūrā, kvantitatīvi noteikts, izmantojot HIV-3,000 Gag p1 Quantikine ELISA komplektu (R&D Systems), sadalīts 24% liellopu augļa serumā (Sigma-Aldrich) un uzglabāts -50 ° C temperatūrā līdz. izmantot. Lai inficētu HEK-ACE80 šūnas, tika izmantoti dažādi pseidotipizētu vīrusu daudzumi (ko noteica HIV-1 p24 proteīna līmenis), un 2 stundas vēlāk ugunspuķes luciferāzes aktivitāte tika mērīta, izmantojot Luciferase Assay Reagent (Promega) Glomax 48 mikroplatē. luminometrs (Promega).
Neitralizācijas tests
Pseidotipa vīrusu neitralizācijas testi tika veikti būtībā, kā mēs iepriekš aprakstījām12. Īsumā, plazmas paraugu sērijveida atšķaidījumi (no 1:4 līdz 1:8748) tika sagatavoti DMEM ar 10% liellopu augļa serumu un inkubēti ar 5 ng katra pseidotipa vīrusa p24 1 stundu 37 °C temperatūrā un pēc tam 1 × 104 katrai iedobei tika pievienotas HEK-ACE2 šūnas. HEK293T šūnas (neizpauž ACE2), kas inkubētas ar pseidotipa vīrusu (A līnija), tika izmantotas kā negatīva kontrole. Šūnas tika lizētas 48 stundas vēlāk, un ugunspuķu luciferāzes aktivitāte tika mērīta, izmantojot Luciferase Assay Reagent (Promega) Glomax 96 Microplate luminometrā (Promega). Neitralizācijas procentuālais daudzums katram atšķaidījumam tika aprēķināts un katra parauga ID50 tika aprēķināts, izmantojot GraphPad Prism versiju 9.0.1.
Statistiskās analīzes
Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot GraphPad Prism programmatūras versiju 9.1.2. Vairāku grupu salīdzinājumi neitralizējošo antivielu titru (NAbT) pret SARS-CoV-2 pseidotipa vīrusu paneli, kā arī NAbs reakciju salīdzinājumi pēc dzimuma un dūmu statusa tika veikti, izmantojot pāra Vilkoksona parakstīto ranžēto testu. Faktoru izmaiņas tika aprēķinātas kā ģeometriskā vidējā titra starpība ID50 salīdzinot ar savvaļas tipa pseidotipa vīrusu. Korelācijas analīze starp NAbT un vecumu vai ĶMI tika veikta, izmantojot Spīrmena testu. Infekcijas statistiskai analīzei tika veikts vienvirziena ANOVA un Tukey daudzkārtējais salīdzināšanas tests. P vērtība ≤0.05 tika uzskatīta par statistiski nozīmīgu.
Ētiskā apstiprināšana
Pētījuma protokolu apstiprināja Čīles Universitātes Medicīnas fakultātes Ētikas komiteja (projekti Nr. 0361-2021 un Nr. 096-2020) un Clínica Santa Maria (projekts Nr. 132604-21). Visi donori parakstīja informētu piekrišanu, un viņu paraugi tika anonimizēti.
Lampda varianta smaiļu mutāciju ietekme uz infekciozitāti un neitralizējošo antivielu reakciju
3695 sekvenču analīze no Čīles, kas tika deponētas GISAID 24. jūnijāth 2021. gads parāda nepārprotamu SARS-CoV-2 variantu Gamma un Lambda dominēšanu pēdējā trimestra laikā, kopā veidojot 79% no visām sekvencēm.
Interesanti, ka šo periodu raksturo masveida vakcinācijas kampaņa, kurā 65.6% mērķa populācijas (18 gadus veci un vecāki indivīdi) ir saņēmuši pilnīgu vakcinācijas shēmu 27. jūnijā.th 2021
Ņemot vērā, ka 78.2% cilvēku, kas inokulēti ar pilnu shēmu, saņēma inaktivētu vīrusa vakcīnu CoronaVac no Sinovac Biotech, mēs centāmies izpētīt Lambda variantā esošo smaiļu mutāciju ietekmi uz šīs vakcīnas izraisīto antivielu neitralizēšanas spēju.
Šim nolūkam mēs izveidojām uz HIV-1 balstītus SARS-CoV-2 pseidotipa vīrusus, kas satur smailes proteīnu no Uhaņas-1 atsauces līnijas (savvaļas tips; A līnija), D614G mutācijas (līnija B) un alfa (līnija B) .1.1.7), Gamma (izcelsme P.1) un Lambda (cilts C.37) varianti.
Vīrusa sagatavošanas laikā mēs konsekventi novērojām, ka šūnas, kas inficētas ar pseidotipa vīrusu, kam ir Lambda smaile, radīja ievērojami augstākas bioluminiscences vērtības, salīdzinot ar D614G mutantu vai Alfa un Gamma variantiem, kas norāda uz paaugstinātu inficētspēju, ko izraisa Lambda smaile.
Skaitlis 1.Infekciozitāte, ko izraisa dažādi smaiļu proteīni.
(A) SARS-CoV-2 smaile proteīna un šajā pētījumā izmantoto variantu shematisks attēlojums. Līnijas ir norādītas iekavās. RBD, receptoru saistošais domēns, CM; citoplazmas aste.
(B) Katras līnijas pseidotipu titrēšana, izmantojot līdzvērtīgus HIV-1 p24 daudzumus. Firefly luciferāzes aktivitāte tika mērīta kā relatīvās luminiscences vienības (RLU) 48 stundas pēc inficēšanās. Vidējais un SD tika aprēķināts, izmantojot reprezentatīvu trīskāršu eksperimentu.
Pēc tam mēs izmantojām iepriekš minētos pseidotipizētos vīrusus, lai veiktu neitralizācijas testus, izmantojot 79 plazmas paraugus no veseliem veselības aprūpes darbiniekiem no Čīles Universitātes un Santamarijas klīnikas Santjago, Čīlē.
Mēs izslēdzām 4 paraugus, jo nevarējām aprēķināt ID50 titru. No analizētajiem paraugiem 73% atbilda sievietēm, kuru vidējais vecums bija 34 gadi (IQR 29–43) un ķermeņa maksimālais indekss (ĶMI) bija 25 (IQR 22.7–27). 20.5% dalībnieku atzina, ka ir aktīvi smēķētāji, kamēr ilga imunizācijas periods. Paraugi tika iegūti vidēji 95 dienas (IQR 76–96) pēc otrās CoronaVac vakcīnas devas.
Mēs novērojām, ka pseidotipa vīrusa, kas satur savvaļas tipa smailes proteīnu, neitralizēšana izraisīja 50% inhibējošu atšķaidījumu (ID50) vidējais titrs ir 191.46 (154.9 - 227.95, 95% TI), savukārt tas bija 153.92 (115.68 - 192.16, 95% TI), 124.73 (86.2 - 163.2, 95% TI, CI ) un 104.57 (75.02 – 134.11, 95% TI) pseidotipiskiem vīrusiem, kas pārnēsā attiecīgi D78.75G mutanta vai alfa, gamma un lambda variantu smaiļu proteīnu.
Mēs arī novērojām, ka ID ģeometriskais vidējais titrs50 titri samazinājās par koeficientu 3.05 (2.57–3.61, 95% TI) pseidotipa vīrusam ar Lambda smaili, 2.33 (1.95–2.80, 95% TI) Gamma smailei, 2.03 (1.71, 2.41% TI) 95. Alpha smailei un 1.37 (1.20–1.55, 95% TI) D614G smailei, salīdzinot ar Wild tipa smaili.
Mūsu pētījuma grupā netika novērota korelācija starp dzimumu, vecumu, ķermeņa masas indeksu (ĶMI) vai dūmu stāvokli un neitralizējošu antivielu titriem.
Skaitlis 2.Neitralizācijas tests, izmantojot plazmas paraugus no CoronaVac vakcinētajiem
(A) Izmaiņas savstarpējā 50% neitralizācijas titrā (ID50) plazmas paraugos no 75 CoronaVac vakcīnas pret D614G (līnija B), Alpha (līnija B.1.1.7) saņēmējiem,
Gamma (izcelsme P.1) un Lambda (cilts C.37) varianti, salīdzinot ar savvaļas tipa vīrusu. Rezultāti tiek parādīti kā saskaņoto paraugu neitralizācijas titru atšķirība. P vērtības ID salīdzināšanai50 tiek aprēķināti ar Vilkoksona parakstītā ranga testu.
(B) Kastes diagrammas norādīja ID vidējo un starpkvartiļu diapazonu (IQR).50 katram pseidotipa vīrusam. Faktoru izmaiņas tiek parādītas kā ģeometriskā vidējā titra atšķirība ID50 salīdzinot ar savvaļas tipa pseidotipa vīrusiem. Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot Vilkoksona saskaņoto pāru parakstīto rangu testu.
Kopā mūsu dati atklāja, ka nesen atpazītā interesējošā varianta Lambda smaile proteīns, kas ļoti cirkulē Čīlē un Dienvidamerikas valstīs, satur mutācijas, kas nodrošina paaugstinātu inficētspēju un spēju izvairīties no neitralizējošām antivielām, ko izraisa CoronaVac.
